Das Cenacolo-Museum ist Teil des Klosters der Benediktinerschwestern von Sant'Apollonia, dem größten Frauenkloster von Florenz, das 1339 gegründet wurde. Der Speisesaal wurde 1447 über eine ganze Wand von Andrea del Castagno mit Fresken geschmückt. Der gesamte untere Bereich der Wand ist vom Fresko des Letzten Abendmahls bedeckt: Die Szene spielt in einem reich verzierten Raum, in dem jedes architektonische Element bis ins kleinste Detail ausgearbeitet wurde. Der streng perspektivische Ansatz wird durch den geometrischen Effekt der Linien von Boden und Decke verstärkt. Darüber sind die Auferstehung, die Kreuzigung und die Grablegung dargestellt. 1953 wurde dieser obere Teil zum Zwecke einer besseren Konservierung abgelöst, wobei Sinopien (Vorzeichnungen) zum Vorschein kamen, die an der gegenüberliegenden Wand des Raumes ausgestellt sind. Ferner sind andere Werke von Andrea del Castagno vorhanden, die um die Mitte des 15. Jahrhunderts entstanden sind: Eine mit einem Fresko dekorierte Lünette (und deren Sinopie) mit dem von Engeln gestützten Leichnam Christi, eine Kreuzigung sowie die Sinopie der Vision des Hl. Hieronymus zwischen den Heiligen Paula und Eustachio. An der Südwand des Raumes befindet sich ein Kreuz, das Baccio da Montelupo zugeschrieben wird. Weitere Werke des ehemaligen Klosters aus dem 15. Jahrhundert finden sich im Durchgangsraum, dem Antirefettorio.