Der Garten der Villa, der Botticelli zu seinen Meisterwerken „Geburt der Venus“ und „Frühling“ inspirierte, kann mit Fug und Recht als der Prototyp des italienischen Gartens des 16. Jahrhunderts definiert werden. Die komplexe und außergewöhnliche Ikonographie des Gartens war als Huldigung für die friedensstiftende Rolle und aufgeklärte Herrschaft des neuen Regenten Cosimo I. de’ Medici über die Toskana gedacht. Die Tier- bzw. Sintflutgrotte, welche zu den berühmtesten Europas zählt und von Tribolo entworfen wurde, war einst Schauplatz großartiger Wasserspiele. Zusammen mit dem von Tribolo und Pierino da Vinci gestalteten Hercules- und Antaeusbrunnen spielte sie eine zentrale symbolische Rolle, deren Krönung die Bronzegruppe von Bartolomeo Ammannati bildet. In der „Wildnis“ von Steineichen, Eichen und Zypressen beeindruckt das große Zisternenbecken von Vasari, das mit dem Apennin oder Januar geschmückt ist, einer Bronzeskulptur von Ammannati. Zudem kann sich der Garten einer außergewöhnlichen Sammlung an Zitrusgewächsen aus etwa tausend Pflanzen von weltweit einzigartiger historisch-botanischer Bedeutung rühmen. Hierbei handelt es sich um Nachkommen der alten Medici-Sorten mit über dreihundert Jahre alten Exemplaren, die von April bis Oktober im Freien ausgestellt und in den Wintermonaten in den beiden historischen Orangerien untergebracht werden. Auch der Heilkräutergarten ist ein wahres Schmuckstück mit seinem „Stufa dei Mugherini“, der die seltene indische doppelte Jasminart aus Goa, „Mugherino“, beherbergt, die dem Gewächshaus des „Ortaccio“ oder „Geheimen Gartens“ seinen Namen gab.