Die dortigen Gemäldesammlungen umfassen wahre Meisterwerke der Kunst aller Epochen, insbesondere des 14. Jahrhundert und der Renaissance: Giotto, Simone Martini, Piero della Francesca, Beato Angelico, Filippo Lippi, Botticelli, Mantegna, Correggio, Leonardo, Raffaello, Michelangelo, Caravaggio, Canaletto. Bedeutend auch die Sammlungen deutscher, niederländischer und flämischer Maler, darunter Dürer, Rembrandt, Rubens, Goya. Nicht minder eindrucksvoll im Panorama der italienischen Kunst ist die Sammlung der Familie Medici von Statuen und Büsten aus der Antike. Die Sammlung schmückt die Hallen der Galerie und umfasst antike römische Skulpturen, bei denen es sich um Nachbildungen von verlorenen griechischen Originalen handelt. Die Galerie befindet sich im ersten und zweiten Stock des großen, zwischen 1560 und 1580 nach einem Entwurf von Giorgio Vasari errichteten Gebäudes, das als Sitz der Hauptverwaltung des toskanischen Staates diente. Das Museum beherbergt heute auch das berühmte Gabinetto Disegni e Stampe (Kabinett der Zeichnungen und Drucke).