El Cenáculo es parte del monasterio de las Benedictinas de Sant'Apollonia, el más grande monasterio femenino de Florencia, fundado en 1339. Toda una pared del cenáculo fue pintado al fresco por Andrea del Castagno en 1447. La parte inferior de la pared está ocupada por el fresco de la Última Cena: la escena se desarrolla en un ambiente ricamente decorado, donde cada elemento arquitectónico está cuidado en el mínimo detalle. El planteamiento de la perspectiva es riguroso, acentuado por el efecto geométrico de las líneas del suelo y del techo. En la parte superior están representadas la Resurrección, la Crucifixión y la Deposición en el sepulcro. En 1953 se despegaron los frescos de esta parte superior por motivos de conservación y se encontraron las sinopias (dibujos preparatorios), que se pueden contemplar en la pared opuesta de la sala. También se exponen otras obras de Andrea del Castagno realizadas en la segunda mitad del siglo XV: una luneta con frescos (y su sinopia) de Cristo en el sepulcro con dos ángeles, una Crucifixión y la sinopia de la Visión de San Jerónimo entre las Santas Paula y Eustaquia. En la pared sur de la sala se encuentra un Crucifijo atribuido a Baccio da Montelupo. Otras obras del siglo XV procedentes del ex monasterio están expuestas en el anterrefectorio.