Sus colecciones de pinturas comprenden obras maestras absolutas del arte de todos los tiempos, en particular del siglo XIV y del Renacimiento: Giotto, Simone Martini, Piero della Francesca, Beato Angélico, Filippo Lippi, Botticelli, Mantegna, Correggio, Leonardo, Rafael, Miguel Ángel, Caravaggio, Canaletto. Importantes también son las colecciones de pintores alemanes, holandeses y flamencos, entre los cuales Durero, Rembrandt, Rubens y el español Goya. No menos importante en el panorama del arte italiano es la colección de estatuas y bustos de la antigüedad de la familia Médicis. La colección embellece los pasillos de la Galería y comprende esculturas romanas antiguas y copias de originales griegos perdidos. La Galería está situada en la primera y segunda planta del gran edificio construido entre 1560 y 1580 según proyecto de Giorgio Vasari como sede de las principales oficinas administrativas del Estado toscano. El Museo acoge hoy también el célebre Gabinete de Dibujos y Estampas.