El museo tiene su sede en el antiguo Cenáculo del convento erigido al lado de la iglesia de Santo Spirito por los frailes ermitaños de San Agustín. Edificado en el siglo XIV en estilo gótico, es el único ambiente del famoso complejo monumental de Santo Spirito que conserva la estructura original. Su antigua función está recordada por el imponente fresco del siglo XIV de Andrea Orcagna y ayudantes que decora toda la pared oriental, en la parte inferior se ven fragmentos de una Ultima Cena y en la parte superior una magnifica Crucifixión. El fresco no es solo una de las mejores obras de Orcagna sino que es también una de las pinturas murales más grandes del siglo XIV llegada hasta nosotros. En el museo se exponen obras donadas al Ayuntamiento de Florencia en 1946 por el coleccionista y anticuario originario de la región de Campania Salvatore Romano, una valiosa colección de esculturas, fragmentos de decoración arquitectónica, frescos arrancados y mobiliario de diferente origen y de épocas comprendidas entre la antigua Roma y el siglo XVII. Según lo previsto en el documento de donación, la colección conserva todavía hoy la sugestiva presentación, de gusto ornamental y evocativo, que fue realizada bajo la dirección de Salvatore Romano.

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