Das Cenacolo-Museum mit dem bekannten Abendmahl-Fresko von Andrea del Sarto beherbergt seit 1817 Kunstwerke aus den aufgehobenen Kirchen und Klöstern der Stadt Florenz sowie Sammlungen, die aus der Kunstakademie eingezogen wurden. 1511 beauftragte der Abt Ilario Panichi den Künstler Andrea del Sarto mit dem großen Fresko des Letzten Abendmahls an der hinteren Wand des Refektoriums, das er 1527 fertiggestellte. Andrea del Sarto, der sich bei seiner Arbeit vom berühmten Letzten Abendmahl des Leonardo da Vinci in Mailand inspirieren ließ, stellt die Apostel während Jesu Verkündigung des Verrats dar und fügt im oberen Bereich eine kleine, originelle Szene mit zwei Charakteren hinzu, die von einer Terrasse aus dem Ereignis beiwohnen. Der über die Räumlichkeiten des Klosters (Korridor, Küche, Waschküche und Refektorium) verlaufende Museumsrundgang zeigt Gemälde des 16. Jahrhunderts, welche mit exzellenten Beispielen die florentinischen Malerei jener Epoche dokumentieren. Dazu gehören Werke von Pontormo (insbesondere Fede e Carità (Glaube und Nächstenliebe) auf der gegenüberliegenden Seite des Refektoriums, über dem Eingang), Franciabigio, Raffaellino del Garbo, Bachiacca, Carlo Portelli, Bernardino Poccetti sowie eine Gemäldegruppe von Plautilla Nelli (1524-1588) – einer der wenigen von Giorgio Vasari in die Biografie „Vite“ aufgenommenen Künstlerinnen und heute als „erste Malerin in Florenz“ bekannt.