Il Cenacolo è parte del monastero delle Benedettine di Sant'Apollonia, il più grande monastero femminile di Firenze, fondato nel 1339. Il cenacolo fu affrescato su un'intera parete da Andrea del Castagno nel 1447. Tutta la parte inferiore della parete è occupata dall’affresco dell’Ultima Cena: la scena si svolge in un ambiente riccamente decorato, dove ogni elemento architettonico è curato nel minimo dettaglio. L’impostazione prospettica è rigorosa, accentuata dall'effetto geometrico delle linee del pavimento e del soffitto. Al di sopra sono raffigurate la Resurrezione, la Crocefissione e la Deposizione nel sepolcro. Nel 1953 si effettuò il distacco di questa parte superiore per motivi di conservazione e furono trovate le sinopie (disegni preparatori), che sono esposte sulla parete opposta della sala. Sono esposte anche altre opere di Andrea del Castagno dipinte intorno alla metà del Quattrocento: una lunetta affrescata (e la sua sinopia) con il Cristo in pietà tra gli angeli, una Crocifissione e la sinopia della Visione di San Girolamo tra le Sante Paola e Eustachio. Sulla parete sud della sala si trova un Crocifisso attribuito a Baccio da Montelupo. Altre opere quattrocentesche provenienti dall'ex monastero sono esposte nell’antirefettorio.