Le Cénacle fait partie du monastère bénédictin de Sant'Apollonia, le plus grand monastère féminin de Florence, fondé en 1339. Le cénacle fut peint à fresque sur tout un mur par Andrea del Castagno en 1447. Toute la partie inférieure du mur est occupée par la fresque de la Dernière Cène : la scène se déroule dans un environnement richement décoré, où chaque élément architectural est soigné dans les moindres détails. L'approche en perspective est rigoureuse, accentuée par l'effet géométrique des lignes du plancher et du plafond. Au-dessus sont représentés la Résurrection, la Crucifixion et la Déposition dans le tombeau. En 1953, cette partie supérieure fut détachée pour des raisons de conservation et des sinopies (dessins préparatoires) ont été découvertes, qui sont exposées sur le mur opposé de la salle. D'autres œuvres sont également exposées d'Andrea del Castagno peintes vers le milieu du XVe siècle : une lunette à fresques (et sa sinopie) avec le Christ dans la piété parmi les anges, une Crucifixion et la sinopie de la Vision de Saint Jérôme entre les Saintes Paola et Eustache. Sur le mur sud de la salle se trouve un Crucifix attribué à Baccio da Montelupo. D'autres œuvres du XVe siècle provenant de l'ancien monastère sont exposées dans l'anti-réfectoire.