Le musée est situé dans l'ancien Cénacle du couvent construit à côté de l'église du Saint Esprit par les moines ermites de Saint Augustin. Construit en style gothique au XIVe siècle, c'est le seul lieu du célèbre complexe monumental du Saint Esprit qui conserve sa structure originale. Sa fonction ancienne est rappelée par l'imposante fresque du XIVe siècle de Andrea Orcagna et contribue à décorer tout le mur oriental, avec des fragments d'une dernière Cène sur la partie inférieure et une superbe Crucifixion sur la partie supérieure. La fresque n'est pas seulement l'une des meilleures œuvres de l'Orcagna, mais aussi l'une des plus grandes peintures murales du XIVe siècle qui nous soient parvenues. Le musée abrite les œuvres données à la Ville de Florence en 1946 par le collectionneur et antiquaire de la Campanie Salvatore Romano, une précieuse collection de sculptures, fragments de décoration architecturale, fresques détachées et meubles, d'origines diverses et de la période comprise entre la Rome antique et le XVIIème siècle. Comme le prévoit l'acte de donation, la collection conserve encore le cadre suggestif, au goût ornemental et évocateur, qui fut créé sous la direction de Salvatore Romano.

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