Il Cenacolo, col celebre affresco di Andrea del Sarto, divenne sede sin dal 1817 di una raccolta con opere d’arte provenienti dalle chiese e dai monasteri soppressi della città di Firenze e dalle raccolte incamerate dall'Accademia. Il grande affresco raffigurante l’Ultima Cena, sulla parete di fondo del refettorio, fu commissionato dall’abate Ilario Panichi ad Andrea del Sarto, nel 1511 e completato nel 1527. Andrea del Sarto, che si ispirò al famoso Cenacolo di Leonardo da Vinci a Milano, coglie gli apostoli nel momento in cui ricevono l’annuncio del tradimento da Gesù e aggiunge nella parte superiore una piccola e originale scena di due personaggi affacciati a una terrazza che assistono all’evento. Nel percorso museale allestito negli ambienti del convento (il corridoio, la cucina, la sala del lavabo, il refettorio) sono esposti dipinti del secolo XVI che documentano con eccellenti esempi la pittura fiorentina dell'epoca. Tra queste opere di Pontormo (in particolare Fede e Carità, al lato opposto del refettorio, sopra l’entrata), Franciabigio, Raffaellino del Garbo, Bachiacca, Carlo Portelli, Bernardino Poccetti e un nucleo di dipinti di Plautilla Nelli (1524–1588) - una delle rare artiste di cui parla Giorgio Vasari nelle Vite e oggi conosciuta per essere stata la “prima donna pittrice di Firenze”.